DOI: 10.26820/recimundo/7.(1).enero.2023.87-98
URL: https://recimundo.com/index.php/es/article/view/1920
EDITORIAL: Saberes del Conocimiento
REVISTA: RECIMUNDO
ISSN: 2588-073X
TIPO DE INVESTIGACIÓN: Artículo de revisión
CÓDIGO UNESCO: 32 Ciencias Médicas
PAGINAS: 87-98
Técnicas genéticas y moleculares para el diagnóstico de
SARS – Cov-2
Genetic and molecular techniques for the diagnosis of SARS – Cov-2
Técnicas genéticas e moleculares para o diagnóstico da SRA - Cov-2
Diana Carolina Sandoval Benalcázar
1
; Edwin Geovanny Socasi Dioses
2
; Erika Janeth Medina Jadan
3
RECIBIDO: 02/12/2022 ACEPTADO: 26/01/2023 PUBLICADO: 25/02/2023
1. Especialista Gerencia en Salud; Médica; Universidad de Guayaquil; Guayaquil, Ecuador; diana.sandovalb@ug.edu.
ec; https://orcid.org/0009-0008-3580-2165
2. Máster Universitario en Dirección y Gestión Sanitaria; Médico; Universidad de Guayaquil; Guayaquil, Ecuador; edwin.
socasid@ug.edu.ec; https://orcid.org/0009-0007-9195-3868
3. Médica Especialista en Enfermedades Infecciosas; Médico; Investigadora Independiente; Guayaquil, Ecuador; erika-
medina_12@hotmail.com; https://orcid.org/0009-0002-3425-8707
CORRESPONDENCIA
Diana Carolina Sandoval Benalcázar
diana.sandovalb@ug.edu.ec
Guayaquil, Ecuador
© RECIMUNDO; Editorial Saberes del Conocimiento, 2023
RESUMEN
Debido a su condición de pandemia, es imprescindible contar con métodos de diagnóstico confiables para
la determinación de esta infección viral, lo que contribuye a su diagnóstico oportuno, y además reduce la
posibilidad de clasificar a individuos como falsos negativos, los que podrían propagar la enfermedad. La
metodología utilizada para el presente trabajo de investigación, se enmarca dentro de una revisión bibliográ-
fica de tipo documental. La técnica para la recolección de datos está constituida por materiales electrónicos,
estos últimos como Google Académico, PubMed, Science direct, entre otros, apoyándose para ello en el uso
de descriptores en ciencias de la salud o terminología MESH. La información aquí obtenida será revisada para
su posterior análisis. Tanto los métodos diagnósticos como moleculares han demostrado tener altos niveles
de sensibilidad y especificidad en el diagnóstico del Covid 19, sin embargo, las pruebas moleculares como la
prueba de reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR), a pesar de
ser el estándar de oro para el diagnóstico presenta ciertas fallas como altos costos, tiempo de confirmación y
confirmación positiva después de la recuperación del paciente, nuevas técnicas genéticas como SHERLOCK
y DETECTR mediante el sistema de edición genética CRISPR/Cas, han demostrado altos niveles de sensibili-
dad, especificidad y rapidez y menores costos en el diagnóstico del Covid 19.
Palabras clave: Diagnóstico, PCR, Covid, Genética, Molecular.
ABSTRACT
Due to its pandemic status, it is essential to have reliable diagnostic methods to determine this viral infection,
which contributes to its timely diagnosis, and also reduces the possibility of classifying individuals as false
negatives, which could spread the disease. The methodology used for this research work is part of a docu-
mentary bibliographic review. The data collection technique is made up of electronic materials, the latter such
as Google Scholar, PubMed, Science Direct, among others, relying on the use of descriptors in health sciences
or MESH terminology. The information obtained here will be reviewed for further analysis. Both diagnostic and
molecular methods have been shown to have high levels of sensitivity and specificity in the diagnosis of Covid
19, however, molecular tests such as the real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)
test, Despite being the gold standard for diagnosis, it has certain flaws such as high costs, confirmation time
and positive confirmation after patient recovery, new genetic techniques such as SHERLOCK and DETECTR
through the CRISPR/Cas gene editing system have shown high levels of sensitivity, specificity and speed and
lower costs in the diagnosis of Covid 19.
Keywords: Diagnostic, PCR, Covid, Genetics, Molecular.
RESUMO
Devido ao seu estatuto pandémico, é essencial ter métodos de diagnóstico fiáveis para determinar esta in-
fecção viral, o que contribui para o seu diagnóstico atempado, e também reduz a possibilidade de classificar
os indivíduos como falsos negativos, o que poderia propagar a doença. A metodologia utilizada para este
trabalho de investigação faz parte de uma revisão bibliográfica documental. A técnica de recolha de dados é
composta por materiais electrónicos, estes últimos como Google Scholar, PubMed, Science Direct, entre ou-
tros, apoiando-se na utilização de descritores em ciências da saúde ou terminologia MESH. A informação aqui
obtida será revista para uma análise mais aprofundada. Tanto o diagnóstico como os métodos moleculares
demonstraram ter elevados níveis de sensibilidade e especificidade no diagnóstico do Covid 19, no entanto,
testes moleculares como o teste da reacção de transcrição inversa em cadeia da polimerase em tempo real
(RT-qPCR), apesar de ser o padrão de ouro para o diagnóstico, tem certas falhas, tais como custos elevados,
tempo de confirmação e confirmação positiva após a recuperação do paciente, novas técnicas genéticas
como SHERLOCK e DETECTR através do sistema de edição genética CRISPR/Cas mostraram elevados níveis
de sensibilidade, especificidade e rapidez e custos mais baixos no diagnóstico do Covid 19.
Palavras-chave: Diagnóstico, PCR, Covid, Genética, Molecular.
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Introducción
El Secretario General de la OMS Tedros Ad-
hanom Ghebreyesus en la rueda de prensa
celebrada el 16 de marzo del 2020, reco-
mendaba “hacer pruebas, pruebas y más
pruebas”, es la mejor estrategia de lucha
contra la COVID-19. En esos momentos, las
incógnitas sobre cuál de todas, y qué con-
venía medir, eran para resolverse de inme-
diato dada la urgencia que suponía la pan-
demia. (Carranza et al., 2020)
Debido a su condición de pandemia, es im-
prescindible contar con métodos de diag-
nóstico confiables para la determinación de
esta infección viral, lo que contribuye a su
diagnóstico oportuno, y además reduce la
posibilidad de clasificar a individuos como
falsos negativos, los que podrían propagar
la enfermedad. (Aguilar Ramírez et al., 2020)
Las pruebas diagnósticas para detectar el
SARS-CoV-2 aún están evolucionando y es
importante comprender sus particularida-
des para la interpretación correcta de los
resultados. (García & Monteagudo, 2020) La
realización de pruebas moleculares requie-
re considerable inversión financiera y logís-
tica, en comparación con otras herramien-
tas de diagnóstico. La prueba de referencia
sugerida por la Organización Mundial de la
Salud (OMS) para la detección del SARS-
CoV-2 es la prueba de reacción en cadena
de polimerasa con transcripción inversa en
tiempo real (RT-qPCR), la cual requiere de
un laboratorio molecular, con infraestructu-
ra, equipos y reactivos costosos, así como
personal especializado. (Escalante-Maldo-
nado et al., 2021)
En concordancia con la aparición de nue-
vas variantes del virus con un potencial de
diseminación mucho mayor a la cepa origi-
nal del SARS-CoV-2, la Organización Mun-
dial de la Salud (OMS) está incentivando el
desarrollo de nuevas herramientas de diag-
nóstico molecular que soslayen las dificul-
tades antes mencionadas de la RT-qPCR, y
que mantengan su buen grado de sensibili-
dad y especificidad. Algunas metodologías
TÉCNICAS GENÉTICAS Y MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO DE SARS – COV-2
de diagnóstico molecular han surgido en los
últimos tiempos, como RT-LAMP, DETECTR
y SHERLOCK (basado en el sistema CRIS-
PR/Cas), y amplificación por polimerasas y
recombinasas (RPA), entre otras, todas con
sensibilidad y especificidad variables. De
todas las metodologías anteriormente men-
cionadas, la técnica RT-LAMP ha demostra-
do un enorme potencial en el diagnóstico
de SARS-CoV-2 y podría ser una metodo-
logía útil para complementar el diagnóstico
de COVID-19 en centros de salud con bajos
recursos. (Hurtado et al., 2022)
Metodología
La metodología utilizada para el presente
trabajo de investigación, se enmarca den-
tro de una revisión bibliográfica de tipo do-
cumental, ya que nos vamos a ocupar de
temas planteados a nivel teórico como es
Técnicas genéticas y moleculares para el
diagnóstico de SARS – Cov-2. La técnica
para la recolección de datos está constitui-
da por materiales electrónicos, estos últimos
como Google Académico, PubMed, Scien-
ce direct, entre otros, apoyándose para ello
en el uso de descriptores en ciencias de la
salud o terminología MESH. La información
aquí obtenida será revisada para su poste-
rior análisis.
Resultados
Pruebas rápidas
Las pruebas rápidas son técnicas que de-
tectan la presencia de la infección por di-
versas metodologías, usualmente a través
de la detección de antígenos virales. Todas
ellas tienen una característica común, su
tiempo de lectura es inferior a 30 minutos.
Estas pruebas requieren un equipamiento
mínimo y pueden realizarse por fuera del la-
boratorio clínico. Debido a que la detección
depende de la carga viral o de los niveles
de antígenos o anticuerpos, tienen menos
sensibilidad que otras pruebas. Sin embar-
go, debido a sus resultados rápidos, son
una alternativa importante para el análisis
masivo inicial de pacientes.
90
RECIMUNDO VOL. 7 N°1 (2023)
Pueden ocurrir casos de falsos negativos por
una muestra inadecuada o insuficiente, fallos
en los kits de prueba y baja carga viral en es-
tadios iniciales. Los falsos positivos se pue-
den presentar por reactividad cruzada con
otros virus respiratorios. Teniendo en cuenta
lo anterior, es valioso el uso de pruebas rápi-
das en casos de brotes, sin dejar de conside-
rar las posibles limitaciones en relación a la
sensibilidad diagnóstica, cuyo factor decisi-
vo es la carga viral. (Rivera et al., 2022)
Pruebas serológicas
Se basan en la detección de las inmuno-
globulinas M (IgM) y G (IgG) contra SARS-
CoV-2. Los anticuerpos IgM comienzan a
ser detectables en sangre después de la
primera semana de inicio de la infección, y
perduran alrededor de 3 o 4 semanas, en
tanto que los anticuerpos IgG aparecen
poco después, y perduran en el tiempo. El
punto óptimo para la detección de anticuer-
pos tipo IgM es entre los 8 a 14 días des-
pués del inicio de síntomas La sensibilidad
en la detección de la IgG parece depender
del momento de la toma de muestra y pue-
de ser mayor al 90% a partir de la segunda
semana del inicio de los síntomas. Aunque
poseen una limitada capacidad para dis-
criminar entre infección actual e infección
pasada, su uso podría contribuir de manera
significativa al diagnóstico clínico, particu-
larmente en pacientes hospitalizados, en
quienes las pruebas moleculares hayan re-
sultado negativas o no se hayan realizado.
(Rivera et al., 2022)
Imagen 1. Detección de la viremia, antigenemia y anticuerpos durante la infección agu-
da por SARS-CoV-2
Fuente: Adaptado de Características del SARS-CoV-2, COVID-19 y su diagnóstico en el
laboratorio, por Rivera et al., 2022, Medicina & Laboratorio.
Reacción en cadena de la polimerasa
Conocida como PCR, es una técnica ge-
nética utilizada para copiar y sintetizar
ADN de un organismo objetivo en grandes
cantidades. Por su parte, en la RT-PCR, la
transcriptasa inversa sintetiza ADNc a partir
de una molécula de ARN antes de iniciar-
se el proceso de amplificación del material
genético. Esta prueba se considera el es-
SANDOVAL BENALCÁZAR, D. C., SOCASI DIOSES, E. G., & MEDINA JADAN, E. J.
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tándar de oro para el diagnóstico de infec-
ción por SARS-CoV-2. Una de las variantes
de la RT-PCR es la RT-PCR en tiempo real
(RT-qPCR), en la cual se utiliza un marca-
dor fluorescente que permite monitorizar la
amplificación del material genético viral en
tiempo real. También debe tenerse presente
que los pacientes en fase de recuperación
de COVID-19 pueden tener una RT-PCR po-
sitiva, ya que la prueba no permite discrimi-
nar entre partículas virales intactas de ARN
viral. Por su parte, la PCR múltiple utiliza la
amplificación simultánea de distintos genes
en un único tubo de reacción, lo cual au-
menta la sensibilidad de la prueba, evitan-
do los falsos negativos. (Rivera et al., 2022)
Tabla 1. Ventajas y desventajas de las pruebas diagnósticas para covid-19
Fuente: Adaptado de Utilidad de Pruebas de cadena de polimerasa, pruebas rápidas y
Tomografías en pacientes con Covid-19, Calvache et al., 2020, Journal of American Health.
La técnica PCR
Antes de iniciar los ciclos de la PCR, se
debe aislar el ADN de la muestra tomada,
de una forma manual o automatizada. Esto
dependerá del laboratorio y sus recursos.
Por lo general, este es un proceso largo de
múltiples pasos. Una vez aislado el ADN
diana, se inician los ciclos de PCR.
TÉCNICAS GENÉTICAS Y MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO DE SARS – COV-2
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RECIMUNDO VOL. 7 N°1 (2023)
Tabla 2. Ciclos de PCR
Fuente: Adaptado de La PCR como prueba para confirmar casos vigentes de COVID-19,
por Carranza et al., 2020, Recimundo.
Protocolos estandarizados y precisión en
el diagnóstico molecular
Según la OMS, en el caso del SARS-CoV-2,
la detección del gen de la proteína E se em-
plea como primera prueba confirmatoria,
seguida de la expresión del gen RdRp. La
expresión del gen N solo se usa si se requi-
riese un ensayo confirmatorio adicional. Para
los Centros para el Control y la Prevención
de Enfermedades (CDC, por sus siglas en
inglés), la primera prueba confirmatoria se-
ría la expresión y secuenciamiento del gen N
diseñado para la detección universal de los
coronavirus SARS y del SARS-CoV-2, para
lo cual se utilizan dos cebadores diferentes.
SANDOVAL BENALCÁZAR, D. C., SOCASI DIOSES, E. G., & MEDINA JADAN, E. J.
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Tabla 3. Comparación del ensayo de diagnóstico molecular por RT-PCR realizado por la
OMS y por los CDC para diagnosticar el SARS-CoV-2
Fuente: Adaptado de Pruebas diagnósticas para la COVID-19: la importancia del antes y
el después, por Aguilar Ramírez et al., 2020, Horizonte Médico (Lima).
La sensibilidad analítica de la RT-PCR se ve
influida por la baja carga viral en pacientes
asintomáticos o levemente sintomáticos,
lo que ocurre, fundamentalmente, en dos
momentos: 1) la fase inicial de la infección,
cuando el paciente todavía es completa-
mente asintomático o solo levemente sinto-
mático, y 2) cuando la infección por SARS-
CoV-2 es controlada por el sistema inmune,
y los síntomas se alivian, con la consecuente
eliminación de virus aún persistentes. Otro
problema es la aparición de mutaciones que
son atribuibles a las ARN polimerasas de-
pendientes de ARN propensas a errores de
coronavirus. (Aguilar Ramírez et al., 2020)
Amplicación isotérmica mediada por
bucle (LAMP)
Imagen 2. Flujograma conceptual de la prueba LAMP para detectar SARS-CoV-2 en
muestras de hisopado nasal. A) La reacción de RT-LAMP a partir de muestras de hisopa-
do nasofaríngeo de individuos con sospecha de Covid-19 se ejecuta a partir de: i) ARN
extraído o ii) directamente de las muestras sin extracción de ARN, con un previo paso de
inactivación a 95 °C por 5 minutos. B) La RT-LAMP hace uso de 6 cebadores (marcados
aquí en colores) que, en presencia del ARN diana (espiral de color rojo), inician la amplifi-
cación isotérmica, generando protones que inducen un cambio de pH en la reacción, con
la subsecuente virada de color de rosa a amarillo. C) La reacción de amplificación en RT-
LAMP genera productos de diferentes masas moleculares en forma de concatámeros que
pueden observarse fácilmente en un gel de agarosa
Fuente: Adaptado de Validación clínica de la prueba RT-LAMP para el diagnóstico rápi-
do del SARS-CoV-2, por Hurtado et al., 2022, Biomédica.
TÉCNICAS GENÉTICAS Y MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO DE SARS – COV-2
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RECIMUNDO VOL. 7 N°1 (2023)
Imagen 3. Resultado colorimétrico de RT-LAMP. Reacción color rosa: muestra negativa
para SARS-CoV-2. Reacción color amarillo: resultado positivo para el gen N del SARS-
CoV-2
Fuente: Adaptado de Validación clínica de la prueba RT-LAMP para el diagnóstico rápi-
do del SARS-CoV-2, por Hurtado et al., 2022, Biomédica.
Esta prueba utiliza entre 4 a 6 primers o ce-
badores, diseñados para unirse a diferentes
regiones del genoma viral, permitiendo la
identificación de secuencias de ARN de in-
terés. A mayor número de primers utilizados,
mayor especificidad de la prueba. Entre las
ventajas de LAMP, está que la amplificación
se realiza a una temperatura constante, la
exclusión de un termociclador, un resultado
de prueba más rápido y mayor capacidad
de diagnóstico, mientras mantiene una sen-
sibilidad y especificidad cercanas al 100%.
El uso conjunto de las pruebas serológicas
y la detección del ARN viral aumenta la sen-
sibilidad diagnóstica en pacientes con CO-
VID-19, así lo demostró Zhao en su investi-
gación, donde la presencia de anticuerpos
IgM e IgG fue menor al 40% en la primera
semana desde el inicio de la infección, y au-
mentó rápidamente hasta el 100% para el
día 15 con una presencia de IgM e IgG en el
94,3% y el 79,8% de los casos, respectiva-
mente; por otra parte, la detección del ARN
disminuyó del 66,7% en las muestras reco-
lectadas antes del día 7, al 45,5% durante
los demás días. Esto sugiere que la com-
binación de detección del ARN y anticuer-
pos influye positivamente en la sensibilidad
diagnóstica, incluso en las fases tempranas
de la infección. (Rivera et al., 2022)
Técnica o proceso en base a estudio de
Hurtado et al (2022) de 177 muestras
• Extracción de ARN: 117 muestras se
sometieron a extracción de ARN a par-
tir de 200 μΙ de hisopado nasofaríngeo
contenido en medio de transporte viral
con el kit de extracción) que emplea
perlas magnéticas de sílice para la pu-
rificación del ARN total. En seguida, se
adicionaron 400 μΙ de solución tampón
de ARN viral a cada 200 μΙ de muestra
(2:1) y se mezcló suavemente. Posterior-
mente, se realizaron lavados sucesivos
para, finalmente, eluir el ARN en 15 μl de
agua libre de ADNasa/RNasa.
• RT-qPCR: Se emplearon 8 μl de solu-
ción tampón de reacción 2X que conte-
nía 0,4 mM de cada dNTP, 3,2 mM de
MgSO4, 0,3 μl de transcriptasa inversa
(SuperScript III RT/Platinum Taq Mix),
200 nM de cada cebador dirigido con-
tra el gen E del SARS-CoV-2 y 100 nM
de sonda TaqMan conjugada al fluoró-
foro CAL Red 610. Además, se introdujo
un control endógeno a la reacción (gen
RNase P humano), 100 nM de cada ce-
bador y 100 nM de sonda TaqMan-Hex,
para su amplificación. Los cebadores
empleados para amplificar un fragmento
del gen E que codifica para la envoltura
SANDOVAL BENALCÁZAR, D. C., SOCASI DIOSES, E. G., & MEDINA JADAN, E. J.
95
RECIMUNDO VOL. 7 N°1 (2023)
del virus (específico del subgénero Sar-
becovirus) fueron proporcionados por
Biosearch Technologies™.
• RT-LAMP: Esta técnica de amplificación
isotérmica se preparó con el kit Warm-
start colorimetric LAMP 2X Master Mix
(DNA & RNA) (NEB), siguiendo las re-
comendaciones de la casa comercial.
En ella, se emplea un conjunto de seis
cebadores para lograr la amplificación
mediada por lazos. Ambos juegos de
cebadores amplifican un segmento del
gen N del SARS-CoV-2, con 229 pares
de bases para el primero y con 217 pa-
res para el segundo. Como control po-
sitivo, en las reacciones de RT-LAMP
se incluyó un plásmido que tiene clona-
do un fragmento del gen N del SARS-
CoV-2, adquirido de la casa comercial
New England Biolabs (NEB, Germany).
Antes de cada reacción LAMP, se preparó
una mezcla 10X de cebadores de único uso
y se procedió a realizar una corta incuba-
ción a 95 °C por 5 minutos, para eliminar
cualquier formación de estructuras secun-
darias que pudieran afectar el cambio de
color de la reacción. La concentración final
de los cebadores en la reacción, después
de agregar los demás reactivos, fue de 1X.
La reacción LAMP se preparó empleando
10 μΙ del reactivo colorimétrico Warmstart
colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNA &
RNA), 5 μl de agua, 3 μΙ del ARN previa-
mente extraído y 2 μl de la mezcla maestra
10X del respectivo set de cebadores que
anteriormente había sido incubado a 95 °C.
La mezcla de cebadores 10X se adicionaba
siempre en la tapa del tubo de la reacción,
con la finalidad de evitar su degradación,
así como amplificaciones inespecíficas que
pudiesen empezar antes de la temperatura
óptima de amplificación.
La reacción se iniciaba con un spin de los
tubos a 65 °C por 30 minutos, en un termoci-
clador (SimpliAmp Thermal Cycler™, Ther-
mo Fisher Scientific). Transcurrido el tiempo
de incubación, se visualizaba el resultado
por colorimetría y se registraba fotográfica-
mente con la cámara de un teléfono celular.
El cambio de color de rosa a amarillo era in-
dicativo de una reacción positiva, mientras
que, si el color rosa se mantenía en la re-
acción, era señal de un resultado negativo
para SARS-CoV-2 (Imagen 3). (Hurtado et
al., 2022)
Extracción de ácidos nucleicos (ARN)
Imagen 4. Los tres métodos de extracción de ARN más utilizados en la actualidad
Fuente: Adaptado de Comparación de técnicas moleculares para el diagnóstico de la in-
fección por SARS-CoV-2 o COVID 19, por Santamaria Celin, 2021, Universidad de los Andes.
TÉCNICAS GENÉTICAS Y MOLECULARES PARA EL DIAGNÓSTICO DE SARS – COV-2
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RECIMUNDO VOL. 7 N°1 (2023)
Entre las técnicas disponibles están aque-
llas que se hacen de forma manual. Las ex-
tracciones manuales más comunes son las
que involucran fenol-cloroformo. Gracias a
la separación en dos fases de estos com-
ponentes, se permite dividir las moléculas
orgánicas en sus solventes con mayor afi-
nidad. Esta técnica de extracción tiene la
ventaja de tener un muy alto rendimiento de
la extracción de RNA y un bajo costo, sin
embargo, estas extracciones suelen tener
la limitante de que la calidad de la extrac-
ción no suele ser óptima.
Otra forma de extracción del ARN más ade-
cuada para centros de procesamiento ma-
sivo puede ser un robot de extracción de
ARN. Estos sistemas se basan en el uso
perlas magnéticas afines a los ácidos nu-
cleicos, las cuales pueden ser recuperadas
usando un imán. Cuando el imán esta acti-
vo se pueden hacer múltiples lavados que
permiten remover los contaminantes de la
muestra tales como carbohidratos y proteí-
nas. Luego de estos lavados se puede des-
activar el imán, lo que permite recuperar los
ácidos nucleicos en un buffer de elución.
Aunque estas técnicas de extracción sue-
len ofrecer un volumen relativamente alto
de procesamiento de muestras por día, sus
ventajas se ven contrastadas por el hecho
de ser tediosas y requerir de personal en-
trenado, por lo cual no son óptimas para
ser utilizadas como técnicas POC (point of
care), las cuales son aplicables en centros
de salud, directamente por el personal mé-
dico. (Santamaria Celin, 2021)
Sistema de edición genética CRISPR/Cas
Las herramientas CRISPR de edición gené-
tica son capaces de editar ADN. Esta es su
aplicación más común y se la conoce con
el nombre de aplicaciones CRISPR 1.0.
Sin embargo, algunas variantes de las he-
rramientas CRISPR pueden también editar
ARN, y son conocidas como las aplicaciones
CRISPR 2.0. Existen dos aproximaciones
principales para utilizar las tijeras programa-
bles CRISPR en la detección del coronavi-
rus SARS-CoV-2. La base metodológica de
ambas tecnologías fue desarrollada para
detectar moléculas de ARN y ADN de forma
específica. Recientemente, la pandemia de
COVID-19 ha impulsado su adaptación a la
detección de SARS-CoV-2, una vez se cono-
ció el genoma de este coronavirus.
Las ventajas de la tecnología basada en
CRISPR/Cas sobre RT-qPCR incluyen: espe-
cificidad de un solo objetivo, tiempo de res-
puesta reducido, costo relativamente bajo,
amplificación de señal isotérmica sin nece-
sidad de una configuración de laboratorio
compleja e informes de fácil acceso con ti-
ras de flujo lateral. La primera aplicación del
sistema CRISPR/Cas en el diagnóstico mo-
lecular del coronavirus SARS-CoV-2, fue la
implementación del método SHERLOCK, el
cual está basado en la sustitución en la pla-
taforma CRISPR de la nucleasa Cas9 por la
Cas 13a, cuya actividad es capaz de cortar
RNA (una actividad de RNAsa) en lugar de
DNA. La prueba está dirigida a detectar el
gen de la proteína S (proteína de pico) que
interviene en la entrada del virus a las células
humanas, y el gen ORF1ab que codifica una
replicasa del virus. SHERLOCK es una pla-
taforma de detección rápida, ultrasensible,
precisa y de bajo costo que utiliza como ele-
mento efector la enzima Cas13a. Esta tiene
como característica principal que al ser acti-
vada con la unión del ARN guía al fragmento
complementario de ARN (es decir, cuando
detecta la presencia del ARN diana), degra-
da los fragmentos de ARN presentes.
La segunda tecnología de detección del
coronavirus SARS-CoV-2 basada en CRIS-
PR es el ensayo de flujo lateral DETECTR
(pronunciado en inglés como “detector” de
coronavirus). Esta fue desarrollada inicial-
mente en el laboratorio de Jennifer Doudna
de la Universidad de California en Berkeley.
El sistema de diagnóstico DETECTR es un
poco más complejo, pues para poder apli-
carlo en la detección de coronavirus, cuyo
genoma es una molécula de ARN, lo prime-
ro que hay que hacer es convertirlo a ADN
mediante un ciclo de transcriptasa inversa.
SANDOVAL BENALCÁZAR, D. C., SOCASI DIOSES, E. G., & MEDINA JADAN, E. J.
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RECIMUNDO VOL. 7 N°1 (2023)
Una vez ya en formato ADN, el genoma del
virus puede ser detectado con su guía de
ARN correspondiente y, tras la activación
específica de la nucleasa Cas12a, se pro-
duce la respuesta inespecífica que origina
luz u otra reacción química fácilmente de-
tectable. El método DETECTR es 90% sen-
sible y 100% específico para identificar el
nuevo coronavirus en hisopos respiratorios,
y es económico porque no requiere instru-
mentación de laboratorio costosa.
El ensayo SHERLOCK como DETECTR tie-
nen varias ventajas respecto al ensayo de
RT-qPCR para la detección de SARS-CoV-2,
entre ellas se tienen:
• Sensibilidad comparable con la prueba
estándar RT-qPCR.
• Menor tiempo del ensayo y obtención
de resultados económicos, ya que no
requieren de termociclador.
• Ambos métodos han sido validados en
muestras clínicas con resultados prome-
tedores. (Perón & Izquierdo, 2021)
Conclusión
La pandemia del Covid 19 demostró que
tanto las pruebas genéticas como las prue-
bas moleculares para el diagnóstico del
Covid no están exentas de fallas en cuanto
a los niveles de sensibilidad, especificidad
y tiempo de tardanza en el resultado. La
prueba de reacción en cadena de polimera-
sa con transcripción inversa en tiempo real
(RT-qPCR), recomendada por la OMS y am-
pliamente utilizada en un tiempo importante
de la pandemia, fue objetada por los altos
costos en su aplicación por la cantidad de
equipos y personal que se requiere para su
análisis, a la par del tiempo que se nece-
sita para poder realizar su análisis, ya que
se recomienda su aplicación a la segunda
semana de iniciados los síntomas y por que
después de aliviado los síntomas o en fase
de recuperación el paciente puede seguir
siendo positivo al virus. La Amplificación
isotérmica mediada por bucle (LAMP) tiene
una mayor sensibilidad y especificidad en
conjunto con pruebas serológicas en fases
tempranas de la infección.
El Sistema de edición genética CRISPR/
Cas, mediante el método SHERLOCK, tiene
ventajas en los resultados, análisis y espe-
cificidad, ya que son más rápidos, menor
costo, ya que no se requiere de grandes
equipos ni laboratorios al igual que el mé-
todo DETECTR que, aunque requiere de un
proceso adicional tiene 90% de sensibili-
dad y 100% especificidad. En este contexto
se puede concluir que la prueba que resulte
de mayores niveles de sensibilidad, especi-
ficidad, rapidez y menor costo es la indica-
da para el diagnóstico del Covid 19, siendo
mejor las pruebas genéticas.
Bibliografía
Aguilar Ramírez, P., Enriquez Valencia, Y., Quiroz
Carrillo, C., Valencia Ayala, E., de León Delgado,
J., & Pareja Cruz, A. (2020). Pruebas diagnósticas
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CITAR ESTE ARTICULO:
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SANDOVAL BENALCÁZAR, D. C., SOCASI DIOSES, E. G., & MEDINA JADAN, E. J.
